1.3 引物选择  采用半巢式多重引物PCR方法对TCR-γ基因的重排进行检测.PCR所采用的通用引物包括覆盖所有可变区家族（V γ Ⅰ～V γ Ⅳ）的4个正向引物和连接链（J γ ）的4个反向引物，引物序列见Table1.第2轮PCR中用V γ Ⅰ/B代替第1轮中的V γ Ⅰ/A，同时在4个正向引物的5′端均标记荧光染料，其中V γ Ⅰ，V γ Ⅳ标记同颜色荧光.用此多重引物扩增V γ Ⅰ～V γ Ⅳ的预期片段大小分别为260，180，160，150bp.因V γ Ⅰ与V γ Ⅳ的片段相差110bp，故虽为同颜色荧光，但并不影响相互区分.

　　1.4 半重叠式多重荧光多重引物PCR  向25μL反应体系中加入模板DNA、多重引物、Ampli Taq Gold聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液.PCR反应条 件:94℃变性5min，扩增温度94℃30s，65℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸7min.第2轮PCR中取1μL第1轮PCR的产物为模板，同时用荧光染料标记的正向引物替代第1轮中的相应引物.取5μL PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，同时加入PhiX174DNA分子质量标准，对PCR产物进行初步鉴定.

　　1.5 PCR产物序列测定  为验证本实验中所采用的半巢式多重引物PCR反应的有效性和准确性，取4例经Southern Blot证实有单克隆γ受体重排，并且经多重引物PCR后，其产物在琼脂糖凝胶电泳中片段大小有明显差异的T细胞淋巴瘤DNA样本（Fig1中Lane1，9，11，2的样本），进行基因扫描和基因序列测定.样本的准备:以基因组DNA为模板，用未作荧光标记的多重引物经半重叠式PCR后，取2.5μL PCR产物加入1μL ExoSAP（Amer-sham Biosciences），37℃孵育30min，去除多余的dNTPs和引物，再经80℃，20min灭活处理，用未做标记的正向引物进行DNA序列测定.

　　1.6 基因扫描  给用荧光引物扩增的PCR产物进行基因扫描，上样总量为5μL，其中含有0.5μL PCR产物、0.5μL碱基长度标准参照物（Genescan-500ROX，PE/Applied Biosystems）、2μL甲酰胺及0.5μL上样缓冲液.样本经95℃，2min变性处理后迅速置于冰块中冷却，上样至ABI DNA序列测定仪.PCR产物经分离胶分离后，用GENESCANTM672（ABI373A，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany）扫描分析软件进行分析.

　　2 结果

　　2.1 琼脂糖凝胶电泳  组织标本基因组DNA首先经β-球蛋白引物扩增，证实所提取的DNA样本可用于下游实验时，再用TCR-γ的多重引物进行半重叠式PCR，扩增产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳作初步鉴定，结果见Fig1.