作者简介 :罗祖明教授

　　四川大学华西医院神经科主任医师 ，博士生导师 ;

　　现担任中国中西医结合神经病学专业委员会副主任委员 ，中华医学会四川省神经病学专业委员会、四川省中西医结合神经病学专业委员会主任委员 ;

　　主要研究方向为脑血管病、头痛、痴呆和临床神经生化 ;先后承担国家攻关课题、卫生部课题等12项 ，主编神经病学专著 4部、神经病学教科书 2部 ，发表学术论文 100余篇 ;作为大会主席主办国际临床神经病学学术研讨会 4届。

　　摘要

　　目的观察通心络对预缺血诱导的脑缺血耐受及胶质纤维酸性蛋白 (ＧＦＡＰ)表达的影响。

　　方法将ＳＤ大鼠随机分为通心络组、预缺血组及缺血组 ，分别在 2ｈ的大脑中动脉缺血(ＭＣＡＯ)前 3ｄ给予 10ｍｉｎ的ＭＣＡＯ预处理 (ｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ，ＩＰＣ)或通心络 +预处理或假手术。第二次ＭＣＡＯ后 24ｈ将大鼠处死 ，比较各组大鼠脑梗死体积、脑含水量、组织病理变化及胶质纤维酸性蛋白 (ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ ，ＧＦＡＰ)的表达。

　　结果与缺血组相比 ，预缺血组脑梗死体积缩小 ，脑含水量减少 ，神经元变性坏死减轻 ，同时伴有ＧＦＡＰ表达增高Ｐ <0. 01，而通心络组上述趋势更为显著Ｐ <0. 05。

　　结论通心络有增强预缺血诱导的脑缺血耐受作用 ，促进星形胶质细胞的活化 ，两者具有叠加效应。

　　近年来研究发现 ，预先给予短暂的脑缺血预处理可减轻再次缺血所致的神经损伤 ，此现象被称为脑缺血耐受 (ｉｓｃｈｅｍｉｃｔｏｌｅｒａｎｃｅ ，ＩＴ)，实质上是机体自身的一种内源性保护机制 ，胶质细胞可能对其有重要意义。如何利用药物干预启动并增强这种内源性保护作用 ，将是未来脑缺血研究的热点。

　　通心络是复方中药制剂 ，最初用于缺血性心脏病的治疗。新近研究表明该药可减轻脑缺血再灌注损伤 ，但有关其对脑缺血耐受的影响尚未见报道。本实验利用大鼠局灶缺血预处理模型 ，观察了通心络对脑缺血耐受及星形胶质细胞活化的影响。

　　材料与方法

　　动物分组将 45只体重为 (250～ 320)ｇ的健康雄性Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ大鼠 (由四川大学实验动物中心提供 )随机分为 3组 ，其中通心络组在预缺血 10ｍｉｎ后 ，即开始给予通心络 (石家庄以岭药业股份有限公司提供的原粉 0. 075ｇ/100ｇ/ｄ以生理盐水稀释 )灌胃 ， 3ｄ后再次造成 2ｈＭＣＡＯ ，再灌注 22ｈ后将大鼠处死 ;预缺血组不给药 ，余同通心络组 ;缺血组 :假手术代替预缺血 ，余同预缺血组。

　　预缺血及缺血模型制备采用大脑中动脉二次线栓法 ，给予大鼠 10%水合氯醛 (0. 3ｍｌ/100ｇ)腹腔注射麻醉 ，在其颈部正中切口 ，结扎右颈外动脉 (ＥＣＡ)远端 ，在结扎线近端距分叉 5ｍｍ处剪口 ，将尼龙线从ＥＣＡ残端插入至颈总动脉 (ＣＣＡ)分叉部以上 (19～ 20)ｍｍ ，结扎ＥＣＡ近心端 ， 10ｍｉｎ后抽出栓线 ，完成缺血预处理。 3ｄ后用相同方法再次造成大鼠右侧ＭＣＡＯ 2ｈ ，再灌注 22ｈ后将其处死。以大鼠清醒后出现右侧Ｈｏｒｎｅｒ征及左侧前肢为重的瘫痪 ，并存活到规定时间点作为造模成功标准。假手术仅暴露ＣＣＡ及分叉处 ，不阻断ＭＣＡ。各组术中均用加热板使动物肛温维持在3 7℃左右 ，术后单笼饲养。梗死体积测定各组随机选取 4只动物 ，规定时点处死 ，快速断头取前脑 ，切除额极和枕极 ，以2ｍｍ间距冠状切成 5片 ，浸在 2%ＴＴＣ磷酸缓冲溶液中 ，置于 37℃水浴箱染色 30分钟 ，照相测得各层梗死面积 ，梗死体积 =各层梗死面积之和×层间隔。

　　脑组织含水量测定每组各随机选取 5只大鼠 ，取出脑组织迅速称重 (采用干湿重法 )，置烤箱烤干至恒重 ，计算脑含水量 :脑组织含水量 (%)=(湿重 -干重 )/湿重× 100%。

　　组织病理变化取前囟后 (3～ 6)ｍｍ脑组织 ，用 4%中性多聚甲醛固定 ，脱水 ，常规石蜡包埋 ，并制成 4μｍ切片 ，行ＨＥ染色 ，光镜观察病理变化。

　　免疫组化染色及图像分析石蜡切片脱蜡至水 ， 3%Ｈ2Ｏ2及正常羊血清处理后 ，加入抗ＧＦＡＰ单克隆抗体 (武汉博士德公司 ， 1: 350)， 4℃过夜 ，依此滴加生物素化羊抗小鼠血清及ＳＰ(工作浓度1: 200)， 37℃各孵育 30ｍｉｎ ，ＤＡＢ显色 ，苏木素复染 ，以ＰＢＳ代替一抗作为空白对照。以ＨＥ染色为对照 ，每张切片随机选取 10个高倍视野 ，用美国ＮｉｋｏｎＳｐｏｔ图像采集处理系统采图后 ，采用Ｉｍａｇｅ -ＰｒｏＰｌｕｓ 4. 1专业图像分析软件进行图像分析 ，测量免疫组化染色的平均光密度值 (ＭＯＤ)。各组所选部位相同。

　　统计学处理所有数据以均值±标准差 (ｘ±ｓ)表示 ，组间比较采用方差分析。

　　结果

　　梗死体积预缺血组梗死体积较缺血组减小 (Ｐ <0. 01)，而通心络组此缩小趋势更为明显 ，小于预缺血组 ，差异显著 (Ｐ <0. 05)，见表 1。

　　表 1各组梗死体积比较 (ｘ±ｓ)

　　脑含水量变化预缺血组大鼠缺血侧及非缺血侧脑组织的含水量均较缺血组明显降低 (Ｐ <0.05 )，而通心络组与预缺血组相比又进一步降低 (Ｐ <0. 05)，见表 2。

　　表 2各组脑含水量比较 (ｘ±ｓ)

　　脑组织病理变化 3组大鼠均有神经元变性、坏死 ，但程度不同 ，缺血组最重 ，预缺血组轻于缺血组 ，通心络组最轻。

　　ＧＦＡＰ表达变化 3组大鼠均可见较多的ＧＦＡＰ阳性细胞。活化的星形胶质细胞胞浆呈黄褐色 ，胞体肥大 ，突起增粗、增长 ，染色加深 ，主要分布于梗死灶周围的海马、皮层及皮层下 ，图像分析示预缺血组ＧＦＡＰ表达明显高于缺血组 (Ｐ <0. 01)，而通心络组又较预缺血组进一步增高 (Ｐ <0.05 )，见表 3。

　　表 3各组ＧＦＡＰ表达 (ｘ±ｓ)

　　讨论

　　缺血耐受现象最早被发现于心脏 ，以后越来越多的研究表明 ，其尚存在于肝、肾、小肠及骨骼肌等组织 ，九十年代以来国外有研究发现 ，脑组织也存在缺血耐受 ，其分子机制尚不清楚 ，星形胶质细胞可能参与了脑缺血耐受的诱导和产生。虽然短暂的缺血预处理可诱导缺血耐受已是不争的事实 ，但临床上却不能人为地给病人造成缺血 ，因此 ，能否在已经发生一过性缺血后 ，利用药物干预增强这种机体固有的内源性保护作用 ，正是本研究所关注的问题。

　　通心络胶囊是吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂 ，全方由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍药、冰片等中药组成。具有扩张冠脉 ，改善心泵功能的作用 ，最早用于缺血性心脏病的治疗。后来有越来越多的动物及临床研究证明 ，其尚能使毛细血管内皮细胞和多形核白细胞的黏附性减小 ，降低全血比黏度和脑血管阻力 ，减轻脑缺血再灌注损伤 ，可用于急性脑梗死的治疗 ，但有关该药对缺血耐受性的影响迄今尚未见报道。

　　本研究表明 ，提前给予短暂的大脑中动脉缺血预处理可使再次缺血时脑梗死体积缩小 ，脑水肿及神经元变性、坏死减轻 ，而通心络治疗可使上述神经保护效果更为明显 ，提示通心络可增强局灶性缺血预处理诱导的脑缺血耐受。与此同时 ，我们发现 ，预缺血可诱导星形胶质细胞的特异性标志物ＧＦＡＰ表达增高 ，同时伴有细胞形态的变化 ，包括胞体肥大 ，突起增粗、变长 ，染色加深 ，若在此基础上同时给予通心络治疗 ，则ＧＦＡＰ的表达上调更为明显 ，提示二者对星形胶质细胞的反应性增强和活化可能具有叠加的促进作用。

　　多项研究业已证实 ，星形胶质细胞参与了中枢神经系统内大多数的整合功能。生理条件下 ，它可帮助神经元与环境之间的物质交换 ，向神经元提供营养与隔离 ，清洁神经元周围环境。脑缺血时 ，星形胶质细胞增生异常活跃 ，近年来研究发现 ，其作用已远远超出传统认识的营养支持神经元和清除变性坏死组织的范围 ，因而日益受到关注和重视。脑缺血后星形胶质细胞活化具有复杂的分子机制 ，可通过调节突触活动 ，分泌生长因子、细胞因子、识别分子等多种途径修复受损神经元 ，促进轴突再生、诱导再生神经元的迁移 ，从而恢复神经系统的正常功能。因此 ，促进星形胶质细胞的反应性增强和活化 ，可能是通心络增强脑缺血耐受的机制之一。

　　综上所述 ，本研究初步表明 ，在短暂的局灶性脑缺血后给予通心络治疗 ，可通过促进星形胶质细胞的活化等途径增强脑缺血耐受 ，从而可望为缺血性脑卒中的二级预防性治疗开辟新的途径。