现任重庆医科大学神经病学研究所所长 ，重庆医科大学一附院神经内科教授、博士生导师。兼任中华医学会神经专业委员会常务委员 ，中华医学会重庆分会神经科专业委员会主任委员 ，《中国神经精神疾病杂志》副主编等职。长期从事脑血管疾病的基础与临床研究 ，在国内外发表论文 100余篇 ，出版专著 2部 ，参编多部。获国家科技进步奖三等奖 1项 ，卫生部科技进步二等奖 1项 ，四川科技进步一等奖 1项、三等奖 4项。 2001年获全国优秀科技工作者称号。

　　摘要

　　目的 :探讨通心络对大脑中动脉梗塞后血管内皮生长因子表达的影响。

　　方法 :以线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型 (ＭＣＡＯ )，大鼠随机分为假手术对照组、ＭＣＡＯ组、通心络干预组。以免疫组织化学法及ＨＥ染色法分别检测脑组织病理学变化、ＶＥＧＦ阳性表达。

　　结果 :大脑中动脉梗塞后 ，缺血区神经元变性、坏死、ＶＥＧＦ在半暗带有少量表达 ，经通心络干预后 ，ＶＥＧＦ大量表达。

　　结论 :通心络可通过促ＶＥＧＦ表达上调 ，内皮细胞增殖 ，从而保护脑毛细血管内皮细胞 ，促进毛细血管新生。

　　目前 ，缺血性脑血管病的治疗以溶栓和神经保护治疗为主 ，无论是溶栓 ，还是神经保护治疗 ，目的均为恢复缺血区脑组织的血液供应 ，保护微血管、神经元 ，促进毛细血管新生 ，侧枝循环重建 ，神经结构重塑 ，使神经功能尽快尽可能恢复 [1]。现已证实ＶＥＧＦ是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂源 ，在病理情况下能促进内皮细胞分裂、增殖 ，使毛细血管新生 [2]。因此 ，如何促进血管内皮细胞生长因子表达上调、促脑毛细血管新生 ，是当前脑缺血研究的热点 [3]。迄今 ，在众多中药制剂中 ，尚无一种药物进行过这一方面的研究 ，通心络 [4]是根据中医理论研制而成的含多种虫类中药的复方制剂 ，具有益气活血的功效 ，在脑血管病治疗中具有良好的效果 ，因此本文选择通心络进行研究 ，观察通心络对脑梗塞后ＶＥＧＦ表达的作用。

　　材料与方法

　　主要仪器和试剂  - 70℃冰箱 (Ｓｈａｒｐ ，日本 );微量移液器 (Ｇｉｌｓｏｎ ，法国 );ＢＨ - 2型Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜 (日本 );彩色病理图像分析仪 (日本 );ＶＥＧＦ兔多克隆抗体 (Ｓａｎｔａ，美国 );ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒 (武汉博士德公司 )。

　　实验动物模型 :雄性健康的Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (250± 20ｇ)，采用右侧大脑中动脉线栓法梗塞模型(ＭＣＡＯ)。 3. 5%的水合氯醛腹腔麻醉 (10ｍｌ/ｋｇ)，大鼠仰卧位固定 ，经颈部切开暴露左侧颈总动脉(ＣＡ)、颈外动脉 (ＥＣＡ)、颈内动脉颅外段 (ＩＣＡ)，在颈外动脉近颈总动脉分叉处剪一切口 ，将栓子(尼龙绳线 ，直径 0. 24ｍｍ ，长 20ｍｍ)向颈内动脉颅内方向插入 (17. 5～ 18)ｍｍ遇阻力而停止 ，栓子头端即达大脑中动脉ＭＣＡ起始部。将ＭＣＡ起始部和ＩＣＡ末端同时堵塞 ，同时用Ｚｉｎ氏夹 ，夹闭颈外动脉切口近端 ，缝合皮肤 ，栓塞即告完成。术后 1小时 ，大鼠清醒 ，置单笼饲养观察 ，根据Ｂｅｒｄｅｒｓｏｎ检查评级方法观察记录 ，大鼠术后爬行 ，不能走直线 ，而呈弯向栓塞血管对侧的环状爬行评为Ⅲ级。

　　实验分组 :实验大鼠被随机分成 3组 ，每组 6只。假手术对照组 :手术过程及时间同其他组 ，但不阻断血供。ＭＣＡＯ组 :每日 0. 05ｍｌ/ｋｇ生理盐水连续灌胃 7天后行右侧大脑中动脉梗塞术 ，术后Ⅲ级大鼠入选 ，术后连续生理盐水灌胃 7天。ＴＣＬ干预组 :每日 2. 5ｇ/ｋｇＴＸＬ连续灌胃 7天后行ＭＣＡＯ手术 ，术后连续灌胃 7天。

　　组织学观察

　　大鼠处死后取脑置 10%福尔马林液固定 ，常规切片 ，ＨＥ染色 ，进行组织学观察。

　　ＶＥＧＦ蛋白表达的免疫组化染色

　　给予术后 7天大鼠麻醉后行左心室灌注固定、取脑 ， 4%ＰＦＡ(多聚甲醛 )外固定 ， 10%蔗糖浸泡后 ，液氮连冻 1分钟 ，恒冷切片机上在大脑中部作冠状切片 ，切片冷风吹干 ，纯丙酮室温固定 20～3 0分钟。ＳＡＢＣ法检测ＶＥＧＦ蛋白表达。蒸镏水洗 ，纯甲醇加Ｈ2Ｏ2至 0. 5%，室温浸泡 30分钟 ，以灭活内源性过氧化物酶 ，蒸馏水洗 3次 ，滴加正常山羊血清封闭液 ，室温 20分钟。甩去多余液体 ，不洗。滴加适当稀释的—抗 ， 4℃过液。 0. 1ＭＰＢＳ冼 2分钟× 3次 ，滴加生物素化山羊抗免ＩｇＧ ， 37℃ ， 20分钟 ， 0. 1ＭＰＢＳ洗 2分钟× 3次 ，滴加试剂ＳＡＢＣ ， 20℃～ 37℃ ， 20分钟 ， 0. 1ＭＰＢＳ洗 5分钟× 4次 ，ＤＡＢ显色 ，镜下控制反应时间 ，蒸馏水洗涤 ，脱水 ，透明 ，封片。显微镜观察。统计学分析 :所有资料以Ｘ±ＳＤ表示 ，两组间比较用ｔ检验 ，Ｐ <0. 05为有统计学差异 ，Ｐ <0. 01认为具有显著性差异。

　　结果

　　脑组织病理学改变

　　假手术对照组大鼠皮层组织细胞排列有序 ，细胞结构完整 ，细胞内可见ＮｉＳＳ小体 ，核清楚 ，组织间隙无异常。ＭＣＡＯ组 :神经细胞呈缺血性改变 ，核消失 ，胞体增大 ，染色变淡 ，边缘不规则 ，核固缩 ，细胞周围水肿明显 ，组织结构疏松 ，水肿明显 ，呈海棉状。ＴＸＬ干预组 :缺血神经元数目减少 ，组织结构水肿减轻。

　　ＶＥＧＦ免疫组化及图像分析

　　假手术对照组无ＶＥＧＦ阳性神经元表达 ，ＭＣＡＯ组在缺血中心及周边区神经元、缺血侧软脑膜细胞、海马神经元均有ＶＥＧＦ弱表达 ;与ＭＣＡＯ组比较 ，ＴＸＬ干预组上述部位有ＶＥＧＦ强阳性表达。

　　讨论

　　脑缺血后ＶＥＧＦ的表达与新血管生成

　　血管新生 ，即原有的血管又产生新的血管  5?。成年人器官 ，生理性的血管新生是很少见的。在月经期和妊娠期 ，女性生殖器官可以有血管新生。血管新生还可以发生在病理的情况下 ，例如缺血、炎症、伤口愈合等。血管新生是一个复杂的过程 ，包括一系列衔接非常准确的过程。脑血管闭塞以后 ， 24小时内内皮细胞开始大量增殖 ， 72小时缺血区有新生的毛细血管  6?。毛细血管新生的范围与程度直接关系到缺血边缘区血流的改善 ，影响神经元生理功能的恢复 ，从而决定了患者的预后  1?。新血管的形成来源于先前存在的血管的内皮细胞增殖 ，而内皮细胞增殖 ，有赖于ＶＥＧＦ的刺激  7?。ＶＥＧＦ是一种内皮细胞的特异性有丝分裂源 ，在体外可促进内皮细胞的生长 ，在体内可诱导血管生成  1?。这种作用主要是由于ＶＥＧＦ对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用 ，ＶＥＧＦ对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶短暂地诱导Ｃａ + +释放而发生的  8?。ＶＥＧＦ为分泌性蛋白 ，作用于特异性受体 ，从而保护脑毛细血管内皮细胞 ，防止毛细血管消失 ，同时刺激内皮细胞增殖 ，血管新生 ，神经功能迅速恢复  9、10、11?。

　　通心络对缺血后ＶＥＧＦ表达及新血管生成的作用

　　既往的研究发现 ，脑缺血后血流增加可诱导ＶＥＧＦ的大量表达  12? ，既往的通心络试验表明 ，它具有降低脑缺血后血液黏度 ，降低脑血管阻力 ，增加脑缺血后脑血流量的作用  4?。因此从理论上讲 ，具有诱导ＶＥＧＦ表达的可行性 ，本实验进一步证实了上述观点。在对ＭＣＡＯ大鼠进行通心络预防性和治疗性给药后 ，大鼠脑组织缺血半暗带神经元、海马神经元及软脑膜、室管膜等有大量的ＶＥＧＦ表达 ，结果表明 :通心络能够通过促进ＶＥＧＦ大量表达而保护脑毛细血管内皮细胞 ，防止毛细血管消失 ，促毛细血管新生 ，从而具有脑保护功能。